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poisnão foipossívelo isolamentode
Legionella
spp.porsemeaduradaságuas
recuperada, sendopossível apenasdetecçãomolecular.
Umsistemadedetecçãosensíveleespecíficapara
L.pneumophila
emágua
foi desenvolvidopor Starnbach
et al
. (1989).O sistemabaseia-sena clivagem
doDNAcromossômicode
L.pneumophila
comasenzimasderestrição
EcoR1
e
HindIII
e os fragmentos clonados em um plasmídeo que, posteriormente,
pela análise de Southern, hibridavamnas amostras positivas. As bactérias de
outrosgêneros testadosnãogeraram sinaispositivosnestascondições.
Paramelhorar a detecçãode
Legionella
, Jonas
et al
. (1995) desenharam
iniciadores parao ensaiodePCR apartir da sequênciadogeneque codifica
o 16S rRNA de
L. pneumophila
ATCC 33152 (iniciadores JFP e JRP). Estes
iniciadores após amplificação geravamum fragmentode aproximadamente
350 pb. Este fragmento foi hibridizado com DNA obtido de diferentes
espéciesbacterianasemostrouqueestaestratégiaéespecíficaparamembros
do gênero
Legionella
. Miyamoto
et al
. (1997), apresentaram um trabalho
similarutilizandoa técnicadenestedPCR. ParaaprimeiraetapadaPCR, os
iniciadores LEG-225 e LEG-858 foram utilizados e geraram um fragmento
de 654pb do gene 16S rRNA. Para o segundo passo de PCR, o primeiro
primer (LEG-225) foi substituído por LEG-448 e LEG-858, gerando um
fragmento de 430 pb do gene 16S rDNA. Em seguida um primermarcado
comdigoxigenina foiutilizadocomooprimerdesondagem,poisapresentava
complementariedadeàsposições630-649.
Could
et al
. (2000) testaram osmesmos iniciadores desenvolvidos por
Jonas
et al
. (1995), e confirmaram as 31 culturas positivas, e outras 12 das
181amostrasdeculturanegativa.Os fragmentosdeDNAamplificadodestas
culturas, que resultaram emPCRpositivo, foram sequenciados, permitindo
aconfirmaçãodeque todaspertenciamaogênero
Legionella
.
